Una nuova tecnica di editing del genoma che consente l’inserimento, l’inversione o la cancellazione di lunghe sequenze di DNA nelle posizioni del genoma specificate dall’utente è descritta in due articoli pubblicati su Nature questa settimana. Un approccio a un singolo passo per facilitare questi riarrangiamenti fondamentali del DNA potrebbe fornire un metodo più facile di modifica del genoma in futuro. Il metodo può avere benefici rispetto agli approcci esistenti, come il potenziale di offrire modifiche del genoma su larga scala più precise ed efficienti rispetto agli approcci esistenti, e il fatto che media la ricombinazione piuttosto che fare una rottura che richiede un processo di riparazione da risolvere.
Riprogrammare le sequenze di DNA
Un sistema programmabile per riorganizzare lunghe sequenze di DNA nei genomi potrebbe essere uno strumento utile nel campo della progettazione del genoma. I riarrangiamenti genomici su larga scala sono solitamente effettuati da enzimi come le ricombinasi (che catalizzano la rottura e la ricombinazione del DNA) o trasposizioni (che spostano sezioni di DNA da un luogo all’altro). Se questi enzimi potessero essere programmati per colpire siti specifici, potrebbero essere uno strumento efficace nell’editing del genoma.
DNA e RNA
Nel primo articolo, Patrick Hsu e colleghi descrivono una tecnica per realizzare ricombinasi riprogrammabili per applicazioni di editing del genoma. Le ricombinasi sono guidate dall’RNA, che agisce come un ponte che dirige la ricombinasi verso siti bersaglio e facilita una modifica predeterminata. Questo ponte a RNA contiene una regione che specifica la sequenza di DNA del donatore e una regione separata che specifica il sito di inserimento genomico. Entrambe le regioni possono essere riprogrammate indipendentemente per riconoscere e legarsi a una gamma diversificata di sequenze di DNA o siti di inserimento e consentire un meccanismo generale per diversi tipi di riarrangiamenti del DNA. L’RNA del ponte è più facile da modificare rispetto ai metodi di editing genico esistenti che coinvolgono le ricombinasi convenzionali, che utilizzano un sito di legame proteico-DNA molto più complesso.
In un documento di accompagnamento, Hiroshi Nishimasu e colleghi esplorano le strutture della ricombinasi utilizzando la microscopia crioelettronica, fornendo un riassunto dettagliato del meccanismo d’azione.
Poiché questo lavoro attuale dimostra l’editing del genoma nei batteri, sono necessarie ulteriori ricerche per valutare se questa tecnica sia praticabile e sicura in diverse specie e tipi di cellule, comprese le cellule di mammiferi. In un’accompagnamento News & Views, Connor Tou e Benjamin Kleinstiver suggeriscono che questa tecnologia è “un avanzamento entusiasmante nel campo della modificazione del genoma su larga scala, con un potenziale allettante per molte applicazioni. ”
Design programmabile del genoma
In un salto avanti per l’ingegneria genetica, un team di ricercatori dell’Istituto Arc ha scoperto il meccanismo recombinase a ponte, uno strumento preciso e potente per ricombinare e riorganizzare il DNA in modo programmabile.
Lo studio pubblicato oggi su Nature riporta la scoperta del primo ricombinazione del DNA che utilizza un RNA non codificante per la selezione specifica della sequenza di bersaglio e delle molecole di DNA donatore. Questo RNA a ponte è programmabile, consentendo all’utente di specificare qualsiasi sequenza genomica desiderata come bersaglio e qualsiasi molecola di DNA donatore da inserire.
“Il sistema a RNA a ponte rappresenta un meccanismo biologico fondamentalmente nuovo per la programmazione“, ha dichiarato Hsu, autore senior dello studio e Investigatore principale dell’Istituto Arc nonché Professore Assistente di Bioingegneria presso l’UC Berkeley. “La ricombinazione a ponte può modificare universalmente il materiale genetico attraverso l’inserzione, l’escissione, l’inversione e altro ancora, permettendo un elaboratore di testi per il genoma vivente oltre CRISPR.”
Il senior scientist dell’Arc Matthew Durrant e lo studente di dottorato in bioingegneria di UC Berkeley Nick Perry sono stati i principali autori della scoperta. La ricerca è stata sviluppata in collaborazione con i laboratori di Silvana Konermann, Investigatore principale dell’Istituto Arc e Professore Assistente di Biochimica presso l’Università di Stanford, e Hiroshi Nishimasu, Professore di Biologia Strutturale presso l’Università di Tokyo.
RNA programmabile
Il sistema di ricombinazione a ponte proviene dagli elementi di sequenza di inserzione 110 (IS110), uno dei numerosi tipi di elementi trasponibili – o “geni saltellanti” – che si tagliano e si incollano per spostarsi all’interno e tra i genomi microbici. Gli elementi trasponibili sono presenti in tutte le forme di vita e si sono evoluti in macchine di manipolazione del DNA professionali per sopravvivere. Gli elementi IS110 sono molto minimali, costituiti solo da un gene che codifica l’enzima recombinase, oltre a segmenti di DNA adiacenti che fino ad ora sono rimasti un mistero.
Il laboratorio Hsu ha scoperto che quando IS110 si estrae da un genoma, le estremità del DNA non codificante si uniscono per produrre una molecola di RNA – l’RNA a ponte – che si piega in due anse. Un’ansa si lega all’elemento IS110 stesso, mentre l’altra si lega al DNA bersaglio dove l’elemento verrà inserito. L’RNA a ponte rappresenta il primo esempio di una molecola guida bispecifica, specificando la sequenza sia del DNA bersaglio che del donatore attraverso interazioni di accoppiamento delle basi.
Ogni ansa dell’RNA a ponte è indipendentemente programmabile, consentendo ai ricercatori di combinare qualsiasi sequenza di DNA bersaglio e donatore di interesse. Ciò significa che il sistema può andare ben oltre il suo ruolo naturale che inserisce l’elemento IS110 stesso, consentendo invece l’inserimento di qualsiasi carico genetico desiderabile – come una copia funzionale di un gene difettoso e causatore di malattie – in qualsiasi posizione genomica. In questo lavoro, il team ha dimostrato un’efficienza di inserimento superiore al 60% di un gene desiderato in E. coli con una specificità superiore al 94% per la corretta posizione genomica.
L’RNA come “adattatore universale”
“Questi RNA a ponte programmabili distinguono IS110 da altri recombinasi noti, che mancano di un componente RNA e non possono essere programmati“, ha dichiarato lo studente di dottorato Nick Perry. “È come se l’RNA a ponte fosse un adattatore di potenza universale che rende IS110 compatibile con qualsiasi presa.”
Con ulteriori esplorazioni e sviluppi, il meccanismo a ponte promette di introdurre una terza generazione di sistemi guidati da RNA, espandendosi oltre i meccanismi di taglio del DNA e dell’RNA di CRISPR e interferenza dell’RNA (RNAi) per offrire un meccanismo unificato per i riarrangiamenti del DNA programmabili. Cruciale per lo sviluppo ulteriore del sistema di ricombinazione a ponte per il design del genoma dei mammiferi, il recombinase a ponte unisce entrambi i filamenti del DNA senza rilasciare frammenti di DNA tagliati – evitando una limitazione chiave delle tecnologie attuali di editing del genoma all’avanguardia.
“Il meccanismo di ricombinazione a ponte risolve alcune delle sfide più fondamentali affrontate dagli altri metodi di editing del genoma“, ha dichiarato Durrant, co-responsabile della ricerca. “La capacità di riorganizzare programmabilmente due qualsiasi molecole di DNA apre la porta a avanzamenti nel design del genoma.”
